جستجوی آنزیم کتکول 1و2 دی اکسیژناز در باکتری بومی تجزیه کننده فنل و کلونینگ و بیان ژن مربوطه

ترکیبات زنوبیوتیک و ترکیب های آروماتیک در نتیجه فرآیندهای صنعتی مختلف در طبیعت آزاد می شوند. فنل واحد ساختمانی اصلی بسیاری از ترکیبات سنتزی آروماتیک است. این ماده یکی از سمی ترین مواد موجود در پساب ها شناخته شده و غلظت مجاز آن در اکوسیستم ها بسیار اندک است. در نیم قرن اخیر اثرات زیان آور آلاینده ها آروماتیک، توجه زیادی به خود جلب کرده است. در این مطالعه، حضور ژن رمز کننده آنزیم کتکول 1و2 دی اکسیژناز(cata) در سویه بومی sko-1 بررسی و ژن مربوطه همسانه و بیان شد. بدین منظور dnaژنومی متعلق به باکتری بومی تجزیه کننده فنل استخراج شد و با پرایمرهای شناسایی، واکنش pcr انجام گردید. سپس یک جفت پرایمر با توجه به نواحی حفاظت شده ژن های مجاور طراحی و واکنش pcr با استفاده از آن ها انجام گرفت. محصول pcr تخلیص شد و تعیین توالی گردید و با استفاده از توالی به دست آمده پرایمرهای همسانه سازی طراحی و واکنش pcr با استفاده از آن ها انجام شد. محصول pcr تخلیص شد و در حامل بیانی pet28a(+)، همسانه گردید. پلاسمید نوترکیب در باکتری e.coli dh5? تراریخت شد. به منظور تایید همسانه سازی ، از سلول های تراریخته، پلاسمید استخراج شد. پلاسمید استخراج شده به وسیله pcr آنالیز شد. سپس محصول pcr تعیین توالی گردید. پلاسمیدهای نوترکیب دارای ژن cata، به میزبان بیانی bl21 تراریخت شدند. برای بیان ژن cata، کلونی های مثبت در محیط کشت lb دارای ?g/?l500 کانامایسین، کشت داده شدند. سپس iptg (mm1) به عنوان القاگر به محیط کشت افزوده شد. برای اطمینان از بیان ژن همسانه شده، sds-page انجام شد و محصول kd 38پروتئین نوترکیب مشاهده گردید. پروتئین نوترکیب با ستون ni-nta تخلیص گردید. سپس با توجه به توالی آمینواسیدی مربوط به پروتئین نوترکیب مدل سازی ساختمان سه بعدی آن با استفاده از نرم افزار swiss model انجام شد و توسط نرم افزار pdb viewer مورد بررسی قرار گرفت.